章节

第十四章 基因重组与基因工程

讲授内容

DNA重组的方式和概念    重组DNA技术

学时分配

       4学时

教学目的

1掌握基因重组和重组DNA技术相关概念、目的基因的获取。

2熟悉：转化及转导作用、重组体的筛选、克隆基因的表达、基因载体的筛选、

DNA诊断与基因治疗。

3了解：重组DNA技术、、重要的工具酶制备目的基因的方法、重组DNA技术与医学的关系。

教学重点

重组DNA技术

教学难点

基因载体的筛选

教学方法

启发式为主，讨论式为辅

讲授法，启发式，探究式方法相结合。

教具准备

制作多媒体课件

教学参考资料

1、  沈同.  生物化学.  第二版.北京：高等教育出版社

2、童坦君.生物化学.  第一版.北京：北京大学医学出版社.

3、张廼蘅. 医学分子生物学 . 北京 : 北京医科大学出版社

教学后记

重点介绍基因重组的基本概念以及它们之间的区别。掌握基因工程的基本程序及关键步骤，熟悉一些常用的工具酶。过程比较枯燥，要适当多举一些例子。尽量用动画显示。应用部分可提高学生兴趣，举一些常见应用，如乙肝疫苗。

教师活动

教学内容

学生活动

备注

【引言】

【讲授】

【板书】

【讲授】

【板书】

第 一 节

DNA的重组     

DNA重组的方式：

同源重组、接合作用、转化作用

转导作用、位点特异的重组、转 座

一、             同源重组

发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。

  以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。

Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤：

①两个同源染色体DNA排列整齐

②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体

③通过分支移动产生异源双链DNA

④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：

片段重组体(patch recombinant)

拼接重组体(splice recombinant)

片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。

拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。

二、细菌的基因转移与重组

（一）接合作用

当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。

强调基本概念

结合PPT图片，讲解概念之间的区别

第1学时

10min

10min

教师活动

教学内容

学生活动

备注

【看图】

【讲解】

（二）转化作用

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。        

例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取

（三）转导作用

当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。

三、位点特异重组

位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。

举例说明现在常见的细菌耐药的生物学本质，启发学生的思维，告诉学生现象与本质的关系

强调何为位点特异？

10min

10min

1学时

10min

教师活动

教学内容

学生活动

备注

   【PPT】

【讲授】

【图示】

【讲授】

例 （一）λ噬菌体DNA的整合

λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。

例（二）细菌的特异位点重组

hin为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。

例（三）免疫球蛋白基因的重排

重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。RSS由一个共同的回文七核苷酸序列（CACAGTG）和一个共同的富含A的九核苷酸序列（ACAAAAAACC）组成，中间为固定长度的间隔序列。抗体重链和轻链基因重排后转录成初级mRNA前体，经加工修饰产生成熟的mRNA并翻译成免疫球蛋白。第二次重排发生在成熟B细胞经抗原刺激后,这次重排出现重链基因改变恒定区，即类型转换，其抗原性不变。B细胞分化至此称为浆细胞，它的特点是可以大量分泌抗体，并且是单特异性的抗体。

通过实例说明细菌逃避免疫监视的分子生物学原因，启发学生。

启发学生，为什么机体能产生100多万种蛋白质抗体分子？

难道有100多万个基因存在吗？

5min

5min

教师活动

教学内容

学生活动

备注

【讲授】

【图示】

【讲授】

【小结】

四、转座重组

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。故:由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。

（一）插入序列转座

插入序列(insertion sequences, IS)组成：

①二个分离的、 9－41bp构成的反向重复(inverted repeats, IR)序列。

②特有的正向重复序列  ,位于反向重复序列的侧翼,4~12bp,不同的插入序列所特有。

③一个转座酶（transposase)编码基因 。

转座酶编码基因产物（转座酶）可引起转座。         插入序列转座发生形式：保守性转座、复制性转座

（二）转座子转座

转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列

转座酶编码基因

抗生素抗性等有用的基因

回顾概念和其区别

强调转座的结构基础

重点在转座子的特点

  10min

10min

教师活动

教学内容

学生活动

备注

【图示】

【讲授】

【板书】

【讲授】

第 二 节 

重组DNA技术

重组DNA技术的发展史

1944年  O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年  美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年  美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年  开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年  英国罗林研究所成功的克隆了多莉。

一、重组DNA技术相关概念           

（一） DNA克隆

克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。

技术水平：1、分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 2、细胞克隆3、个体克隆（动物或植物）

DNA克隆:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)  。指含有单一DNA重组体的无性系。或指将DNA重组体引进受体细胞中，建立无性系的过程

讲科学家的故事，引发学生兴趣

讲多莉羊的空隆过程，引发兴趣

1学时

10min

5min

教师活动

教学内容

学生活动

备注

【图示】

【讲授】

【板书】

【讲授】

生物技术工程:  基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等

基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学

目的:① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA  ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）

（二）工具酶

限制性核酸内切酶、 DNA聚合酶Ⅰ、逆转录酶、T4DNA连接酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、Taq DNA聚合酶等

限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶(restriction  endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶

作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。

命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。

Ⅱ类限制性核酸内切酶的特点

1、  识别序列特点—— 回文结构

2、  切口 ：平端切口、粘端切口

3、  不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸，为4、6或8个

举例讲解

用手术刀说明限制性内切酶的重要性

5min

5min

5min

教师活动

教学内容

学生活动

备注

【图示】

【讲授】

【板书】

【讲授】

同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。

同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端

（三）目的基因

我们所需要的DNA序列或基因，就称为目的基因(target gene)或目的DNA (target  DNA )。目的DNA有两种类型：cDNA、基因组DNA

（四）基因载体

定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA

克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。

表达载体(expression vector)

为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体

强调区别

载体就是一种工具，有它才能把我们想要的东西表达出来。

10min

1学时

10min

教师活动

教学内容

学生活动